課題 タンパク質結晶化
実験期間 ２００２年４月５～９月１５日
提出日程 ２００２年９月２７日
指導教員 ： ○田 彰
生徒名 ： ３２６
×江 △二郎
１）目的
タンパク質の代表的な物質である、卵白から抽出されたリゾチームを蒸気拡散法を利用して結晶化を行った。さらに論文などすでにわかっていることなど踏まえて、蒸気拡散法おける結晶化のより良い諸条件の検討を行う。
２）タンパク質結晶化の原理
塩溶液は，タンパク質を均一な表面電荷を持つコロイド粒子とみなし，Debye-Hückel理論で表される非特異的な静電相互作用で説明される．タンパク質分子間に働く相互作用ポテンシャルを図４.５に示す．青線は電気的に中性な分子間に働く相互作用ポテンシャルで，引力部分はファン・デル・ワールス相互作用に相当する．また，赤線は表面電荷による反発力のみを考えたクーロン相互作用を示す．図中のaは純水中のクーロン相互作用で，遠方にまで静電反発力が及んでいる様子を示す．ファン・デル・ワールス相互作用による引力よりも静電反発力のほうがずっと強いため，分子間にはトータルとしては強い斥力が働いている．bは塩を少し加えた低イオン強度でのクーロン相互作用を示す．塩を加えたことによりクーロン相互作用が静電遮蔽を受け，反発力が及ぶ領域が短くなっている．そのため，aの場合に比べてbでは分子同士がさらに接近でき，同じ体積中により多くの分子が溶解できるようになるため溶解度が増大する．これが塩溶効果である．さらに塩を加えると，cに示したようにクーロン反発力はさらに静電遮蔽されるため，近距離力であるファン・デル・ワールス力が顔を出し，分子間に引力が働き出す．そのため，分子同士は凝集し固相が生成するため溶解度は減少する（塩析効果）．
塩析については，上記の説明以外に，加えた塩がタンパク質を溶解している水を取り去ることによっておこるとする考えもある．塩溶・塩析効果は古くから用いられているが，まだそのメカニズムに関しては不明な点が多い。
図４.５ 相互作用ポテンシャル
３）リゾチーム(lysozyme)の基本的性質
１）通称 ムラミダーゼ(muramidase), 正式名をＮ－アセチルムラミドグリカノヒドラーゼ(Ｎ-acetylmuramoylhydrolase)という。卵白リゾチームは分子量約14400で，アミノ酸残基129個からなるポリペプチド鎖１本からなり，分子内に４個の－S－S－結合と含み，アミノ酸排列の完全に決定された酵素タンパク質の1種である。１分子中に原子約1950個を含み，大きさ45×30×30Å(=10‐10ｍ)の楕円体分子(次のページの図) で，一面著しい裂け目をもっている。また、タンパク質データバンクには今までに見つかっているリゾチームなどの変質した構造などの多くの情報がある。
上図左図 リゾチーム分子（灰：炭素，赤：酸素，青：窒素，黄色：硫黄）
上図右図 リゾチーム分子（青：リゾチーム，赤：リゾチームに吸着して特定の構造を持つ水の酸素，これ以外にも構造を持たない多くの水が吸着している）http://www.cir.tohoku.ac.jp/sazaki-p/%20Web_pages/Protein_crystallion/03_What_we_do_not_know.htmlより
２）リゾチームは卵白から精製されたもので，ペプチドグリカン類中のＮ-アセチルムラミン酸のβ－１,4－グリコシド結合およびキチン，キトデキストリン中のＮ-アセチルグルコサ」ミニド結合を加水分解する。この分解作用によってリゾチームは，多くのグラム陽性細菌（Micrococcus luteusが最も作用を受け易い）や一部のグラム陰性細菌の細胞壁を溶解する。
分解の機構(様子)
［至適ｐＨ］ ９.２
［等電点］ １０.５～１１.０
［分子量］ １４,３０７
ニワトリ卵白リゾチーム（塩化リゾチームとして)は、風邪薬にも入っている天然の抗菌剤です。リゾチームはヒトの涙を初めとして、あらゆる動物や植物に含まれる酵素で細菌の感染から生体を防御するのに役立っています。
４）使用器具・薬品
(i)実験装置
基本キット(同じ製品を買い足した)，
電子上皿天秤(安並化学衡器製作所 BP 21S)，
インキュベーター(ＳＡＮＹＯ ＭＩＲ－１５３)，
超純水製造装置 (MILLPORE MILLI－Q ラボ)，
ガラス電極pH計 (東亜電波工業 ＨＭ－７Ｅ)，
マグネットスターラー(ＮAＮＮA ＨI－190M) ，
双眼実体顕微鏡(島津理化 ＳＣＺ)，
パソコン(Apple Power Mac 7600/120)
モノクロＣＣＤカメラ(Ｖｉｘｅｎ Ｂ０５－３М)，
(ii)実験試薬
リゾチーム(卵白製 生化学用 和光純薬)，酢酸(特級試薬 和光純薬)，酢酸ナトリウム三水和物(特級試薬 和光純薬)，塩化リチウム(特級試薬 和光純薬)，塩化ナトリウム(特級試薬 和光純薬)，塩化カリウム(特級試薬 国産化学)，塩化ニッケル(特級試薬 和光純薬)，塩化コバルト(特級試薬 国産化学)，硫酸アンモニウム(特級試薬 国産化学)，硝酸銅三水和物(特級試薬 和光純薬)，硫酸銅五水和物(一級試薬 国産化学)，硫酸ナトリウム(特級試薬 和光純薬)，水酸化ナトリウム(特級試薬 和光純薬)，水酸化カリウム(一級試薬 和光純薬)，７５％乳酸(一級試薬 和光純薬)，クエン酸(特級試薬 和光純薬)，リン酸(特級試薬 和光純薬)
(iii)使用器具
ビーカー(IWAKI GLASS)，メスフラスコ(IWAKI GLASS super grade)，ビュレット(IWAKI GLASS)，ホールピペット(SIBATA)，デジタルマイクロピペット(デジフィットＡ SIBATA)〔ﾏｲｽﾀ-ﾘﾝｸﾞｷｬｯﾌﾟｽ20μlに代わって使用〕
備考：使用器具は、デジタルマイクロピペット以外９７％のエタノールで殺菌した後、超純水で洗浄したものである
５）実験操作
(i)溶液の調整
酢酸 0.1mol/l 400ml 1.0mol/l 200ml
酢酸ナトリウム 0.1mol/l 400ml 1.0mol/l 200ml
酢酸カリウム 0.2mol/l 100ml
乳酸 0.2mol/l 100ml
クエン酸 0.2mol/l 100ml
リン酸 0.2mol/l 100ml
水酸化ナトリウム 0.2mol/l 200ml
水酸化カリウム 0.2mol/l 300ml
塩化ナトリウム 10%(g/l) 200ml 12%(g/l) 100ml
塩化カリウム・塩化ニッケル・塩化コバルト・塩化リチウム・硫酸アンモニウム・硝酸銅・硫酸銅・硫酸ナトリウム―→10％塩化ナトリウムと同じモル濃度(mol/l)に調製
10×X÷58.44(g/l)=100÷58.44≒1.71(mol/l) (X＝分子量)
硫酸アンモニウムは、15％塩化ナトリウムと等しいモル濃度(2.5mol/l)も調製した。
(ii)緩衝溶液の調製
① 酢酸に酢酸ナトリウムを滴下していき,目的のpHに調製(測定時、スターラーを止めた)。
② 酢酸と水酸化カリウム,乳酸と水酸化ナトリウム,クエン酸と水酸化ナトリウム,リン酸と水酸化ナトリウムを１対１の割合で混合。(スターラーを使い混合)
③それぞれの酸溶液と超純水を１対１の割合で混ぜ0.1mol/lのそれぞれの酸溶液を調製。(スターラーを使い混合)
④②・③でつくった溶液で、0.1mol/lの目的のpHの緩衝溶液になるようにビュレットで滴定しながら、pHメーターで測定し目的のpHの緩衝溶液をつくった。(pH測定時には、スターラーを止めた)。
(iii) pHの値
酢酸と酢酸ナトリウム 4.3 4.5 4.8 5.0 5.3 5.5
6.0 6.5 7.0 7.5
酢酸と酢酸カリウム 4.3 4.5 4.8 5.0 5.3 5.5
乳酸と乳酸ナトリウム塩 4.0 4.3 4.5 4.8
クエン酸とクエン酸ナトリウム塩 4.0 4.5 5.0 5.5
リン酸とリン酸ナトリウム塩 4.0 4.5 5.0 5.5
(iv)結晶用外液の調製
緩衝溶液(1mol/l)と沈殿剤溶液を１：１の割合(体積)で混合
(v)結晶用内液の調製
リゾチーム溶液(75mg/ml)と緩衝溶液(1mol/l)と沈殿剤溶液を４：３：３の割合(体積)で混合。
(vi)クリスケムチャンバーへのセッティング
(iv)で調製した結晶用外液を注射器で600μl取り、注入する。
(v)で調製した結晶用内液を20μlにセットしたデジタルマイクロピペットで20μl取
り、注入する。
(vii)保存
気温を２０℃にセットしたインキュベーターに保存
①塩化リチウム，塩化ナトリウム、塩化カリウム，塩化ニッケル，塩化コバルト
リゾチームの結晶化で沈澱剤として、一番良く使われている塩化ナトリウム似た性質を持ったアルカリ金属の塩化物と陽イオンが２価の塩化物。
また、アルカリ金属の各種塩化物は、塩析能力の目安を示すHofmeister系列に従いどのような変化があるのかや、Hofmeister系列に従わないのか試すために行った。
②硫酸アンモニウム，硝酸銅三水和物，硫酸銅五水和物，硫酸ナトリウム
２価の陰イオンである硫酸イオンを使うとどうなるか試すために。
また、昔からタンパク質の結晶化の沈澱剤として使われ、有名な硫酸アンモニウムを使ってみる。
③塩化ニッケル，塩化コバルト，硝酸銅，硫酸銅
“タンパク質結晶の２０～９０wt%は水であり，その大部分は流動的で，結晶格子内を自由に動き回っている。”と言われている。有色の沈澱剤を使って、結晶の純度を見極める。
④乳酸，クエン酸，リン酸
緩衝溶液の違いがどの程度、結晶の成長に影響があるのか調べるため。また、構造が複雑な有機酸とある程度構造が簡単である無機酸での違いも調べる。
|
実験回数 |
気温（℃） |
ｐＨ |
緩衝溶液 |
沈澱剤 |
内液濃度 |
外液濃度 |
緩衝溶液濃度 |
タンパク質濃度 |
|
１ |
１６～１７ |
Ａ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
2 |
１６～１７ |
Ａ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
3 |
１６～１７ |
Ａ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
4 ①～④ |
３０
|
Ａ
|
CH3COOＮａ
|
NaCl
|
３％ |
0.86(mol/l)
|
0.1(mol/l)
|
30(mg/ml)
|
|
⑤ |
２％ | |||||||
|
⑥ |
１％ | |||||||
|
5 |
２０ |
Ａ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
6 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＫ |
KCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
7 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
LiCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
8 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
CoCl2 |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
9 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
NiCl2 |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
10 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
(NH4)2SO4 |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
11 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
Na2SO4 |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
12 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
CuSO4 |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
13 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
Cu(NO3)2 |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
14 |
２０ |
Ｅ |
citrate3- |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
15 |
２０ |
Ｄ |
lactae- |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
16 |
２０ |
Ｅ |
phosphate3- |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
17 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
KaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
18 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＫ |
ＫCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
19 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
(NH4)2SO4 |
0.76(mol/l)1.5倍 |
1.29(mol/l)1.5倍 |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
20 |
２０ |
Ｅ |
citrate3- |
ＫCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
21 |
２０ |
Ｅ |
phosphate3- |
ＫCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
22 |
２０ |
Ｃ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
23 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
４％ ６％ |
0.1(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
24 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
45(mg/ml) |
|
25 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
0.1(mol/l) |
60(mg/ml) |
|
26 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
1.0(mol/l) |
30(mg/ml) |
|
27 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
1.0(mol/l) |
45(mg/ml) |
|
28 |
２０ |
Ｂ |
CH3COOＮａ |
NaCl |
0.51(mol/l) |
0.86(mol/l) |
1.0(mol/l) |
60(mg/ml) |
|
ｐH設定 |
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A＝4.1～5.3 |
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|
|
Ｂ＝4.3～5.5 |
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|
Ｃ＝6.0～7.5 |
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|
|
Ｄ＝4.0～4.8 |
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|
|
Ｅ＝4.0～5.5 |
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１ (pH=4.3) |
実験番号 |
|
|
写真 |
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×40 |
×写真の倍率 |
予備１回目（CH3COOＮａ―NaCl）
１回目のものは、基本実験でもありデータを集めるうえでも重要な実験なので慎重に行った。また、気温を１６～１７℃に保っておこなった。
(インキュベーターなし 発泡スチロールの中で)
|
１ (pH=5.3) |
２ (pH=5.1) |
３(pH=4.6) |
４(pH=4.1) |
|
|
|
|
|
|
×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
|
２日目から結晶が現れ始めた。そして、４日目以降はあまり結晶が成長しなくなった。pHが強いと多くの種結晶ができるためか、小さい結晶がたくさんできるようだった。 | |||
予備2回目（CH3COOＮａ―NaCl）
「１回目より早く結晶化させるとどうなるか。」と考え、平衡用外液のNaClの濃度を５％から7.5％(1.5倍)に変え、結晶化用タンパク質溶液との濃度差を広げてみた。温度を１６～１７度にして、その他は基本実験と同じ条件で行った。
(インキュベーターなし 発泡スチロールの中で)
|
１ (pH=5.3) |
２(pH=5.1) |
４(pH=4.6) |
４ (pH=4.1) |
|
|
|
|
|
|
×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
|
１回目同様に２日目から結晶が現れ始めた。３日目以降、結晶は小さいまま成長しなくなった。１回目と同じような傾向はあるが、全体的に結晶の成長が早く荒くなったようだ。 | |||
予備3回目（CH3COOＮａ―NaCl）
実験操作に慣れてきたので、１回目の実験が本当に正しいのか、確認するために１回目と同じ条件で実験を行った。温度は１６～１７℃で実験を行った。
(インキュベーターなし 発泡スチロールの中で)
|
Ａ(pH=5.3) |
Ｂ(pH=5.1) |
Ｃ(pH=4.6) |
Ｄ(pH=4.1) |
|
|
|
|
|
|
×28 |
×32 |
×32 |
×40 |
|
種結晶を安定させた状態で作りたかっためで、クリスケムチャンバーを動かす事ができず、結晶の成長を観察する事ができなかった。またこれらの写真は、４日目にはじめて観察したときのものである。 １回目より全てのpHでより大きな結晶が成長した。pHに関する傾向は、１回目と同様にpH=5.3が一番大きな結晶を得ることができた。 操作の仕方で､結晶の成長に大きな違いができる事がわかった。 | |||
予備4回目（CH3COOＮａ―NaCl）
１～４は、「温度を上げる全体の蒸気圧上げ１回目より早く結晶化させるとどうなるか考
え本来20℃で行うところを30℃で行った。また、5･6今まで３回の実験で最も結晶の成
長がよかったpH=5.3で、「結晶化用タンパク質溶液のNaClの濃度を２％と１％に下げ
て、結晶化速度を下げたらどうなるか。」を知るため実験を行った｡
(インキュベーター３０℃にした中で)
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１ (pH=5.3) |
２(pH=5.1) |
３(pH=4.6) |
４(pH=4.1) |
|
|
|
|
|
|
×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
|
５(pH=5.3) |
６(pH=5.3) |
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|
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|
|
×40 |
×40 |
|
|
種結晶を安定させた状態で作りたかったためにクリスケムチャンバーを動かす事ができず、結晶の成長を観察する事ができなかった。またこれらの写真も、４日目にはじめて観察したときのものである。 温度を上げた効果はよくわからなかったが、結晶化用タンパク質溶液の沈殿剤の濃度を下げると種結晶が多くできるためか、結晶の成長がわるいことがわかった。 | ||
５回目（CH3COOＮａ―NaCl）
試薬（リゾチーム）を変えたので純度や不純物が違うのでpHをほぼ等間隔で
その他の条件を予備実験と同じにして行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
|
|
|
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
|
５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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|
|
|
|
×40 |
×40 |
|
|
今回の実験では、予備実験で最も結晶が大きくできていたpH=5.3ではなくpH=5.0時の最も大きな結晶ができていた。だけれども、pH=4.0～5.3では、ほとんど同じ大きさのものだった。また、結晶の形も六角形のもので数の少なく２～４個ぐらいの間であった。 | ||
６回目（CH3COOK―KCl）
５回目の条件のナトリウムの部分をカリウムに変えて実験を行った。今までの
結果からクリスケムチャンバーを動かさずに静置しておく方がいいので静置
しておいた。
|
１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
|
|
|
|
|
|
×40 |
×32 |
×32 |
×40 |
|
５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
|
|
|
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|
×40 |
×40 |
|
|
結晶は大きくなった。結晶の大きさの傾向は、予備実験でのデータと同じようだ。しかし、結晶にキズがあるようなものやひびが入っているようなものもあった。 | ||
７回目（CH3COOＮａ―LiCl）
沈殿剤をナトリウムと同じアルカリ金属の塩化物であると塩化リチウムに変えるとどうなるのか行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
|
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|
×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
|
５(pH=5.1) |
６(pH=5.5) |
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|
|
|
|
|
×40 |
×40 |
|
|
カリウム・ナトリウムより大きな結晶ができた。結晶は、２日目から出来始めた。Hofmeister系列でナトリウムより強いリチウムが大きな結晶が出来たという事は、ナトリウムでは塩析能力弱いと言う事かも知れない。しかし、リチウムで出来た結晶の形は歪(対称でない)のある結晶であった。これは、リチウムよる影響ではなく技術的な問題だと思われる｡ | ||
８回目（CH3COOＮａ―CoCl２）
塩化物で有色のものを沈殿剤に使いたかったため行った。
|
１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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|
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
|
５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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|
×40 |
×40 |
|
|
1日後から結晶が出来始めた｡コバルトは,２価の金属イオンなので２倍の塩化物イオンを出すのにも関わらず、同じモル濃度の塩化ナトリウムと同じぐらいの大きさの結晶が出来た。実体顕微鏡で結晶を見てみると赤く見えたので結晶の純度はあまり良いものとは言えないと思う。赤く見えたのは、結晶上のコバルト溶液の影響かもしれない。ｐＨ＝4.8のときが一番大きい結晶が出来た。タンパク質のアミノ酸とコバルトが配位しているのかもしれない。結晶上の存在する塩化コバルト溶液の色である可能性が大きい。 | ||
９回目（CH3COOＮａ―NiCl２）
塩化物で有色のものを沈殿剤に使いたかったため行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
|
５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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|
×40 |
×40 |
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コバルト同様に、１日後から結晶が出来始めた。コバルト同様に２倍の塩化物イオンを放出する。結晶化させる条件が良く似ているコバルトほど、結晶が大きくならなかった。実体顕微鏡で結晶を見てみると、コバルト同様コバルトイオンの色で着色していた。しかし、結晶の大きさの傾向はまったく同じであった。その理由もコバルトと同じ理由だろう。 | ||
１０～１２回目（CH3COOＮａ―硫酸アンモニウム・硫酸ナトリウム・硫酸銅 ＳＯ４2－）
他のタンパク質の結晶化でよく使われていたという硫酸アンモニウムでは結晶ができなかった。そこで、“他の硫酸イオンではどうか？”と、疑問に思い他の硫酸イオン(硫酸ナトリウム・硫酸銅)を使っての実験を思い立った｡しかし、２価の陰イオンの代表的な硫酸イオンでは、まったく結晶化が起こらなかった。
１３回目（CH3COOＮａ―Cu(NO3)2）
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
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×40 |
×40 |
×40 |
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結晶自体は、ある程度大きいものができた。今までの結晶とは違い、横長のものが多かった。抗菌性がある銅で、カビが繁殖してしまった。そのため結晶の観察ができなかったものもできてしまった。 | |||
１４回目（citrate3－―NaCl）
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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大きな結晶は、できなかった｡しかし、ｐＨ＝4.8～5.0で一番大きな結晶ができる傾向は変わらなかった。クエン酸分子は、酢酸分子より大きな構造なので結晶中に取り込まれにくいため大きな結晶ができると考えていた。それは、酢酸分子よりクエン酸分子の方が構造が複雑なのが原因なのかも知れない。１日後に観察したとき、動かしたのも原因かも知れない。 | |||
１５回目（lactate－―NaCl）
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１ (pH=4.0) |
２(pH=4.3) |
３(pH=4.5) |
４(pH=4.8) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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体内でタンパク質を硬化させる物質である乳酸を使ったら、結晶が出来やすいのではないかと考えた。予想と反して、結晶は小さいものしかできなかった。乳酸がタンパク質を硬化させているかはわからないが、分子構造がアミノ酸に似ている部分もあるので立体的障害になったのかも知れない。１日後に観察したとき、動かしたのも原因かも知れない。 | |||
１６回目（phoshate3－―NaCl）
緩衝溶液を変えたかったため行った。そして、緩衝溶液を無機物に変えたらどうなるか試したかった。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=5.0) |
４(pH=5.5) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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あまり大きな結晶は、できなかった。１日後に観察したとき、動かしたのも原因かも知れない。結晶の大きさの傾向は、どの緩衝溶液でもほぼ同じであった｡無機酸・有機酸の違いによる変化はわからなかった。 | |||
１７回目（CH3COOＮａ―KCl）
カリウムとナトリウムという電離している物質があるときでは、どうなるのか知りたかったため行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×32 |
×32 |
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今までの結晶と大きな変化といえるものは、なかった。しかし、大きさの傾向は同じであったが、pH=4.5とpH=4.8との間で大きな差が出たの理由がわからなかった。 | |||
１８回目（CH3COOK―KCl）
カリウムだけの検証実験を行う。（一回だけだと正しいか分からないため）
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×32 |
×32 |
×40 |
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５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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×32 |
×32 |
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一回目より大きな結晶ができた。今回は、種結晶の数が少なかったため結晶数が少なく、大きな結晶が出来たのだと思う。 | ||
１９回目（CH3COOＮａ―（NH４）２SO４）
もう一度実験をやり、結晶ができるか検証を行う。
結果的には結晶は出来なかったが、硫酸イオンでは結晶が出来ないことがわかった。
２０回目（citrate3－―NaCl）
塩化カリウムと酢酸ナトリウムときでは、大きな結晶ができたので緩衝溶液を変えたときの変化が知りたかったため行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×24 |
×28 |
×24 |
×20 |
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予想どおり結晶は、大きな物ができた。結晶の形も、六角柱もので結晶の数も少なく３～４個だった。結晶の大きさの傾向は、今までのものとは違ったよい結果といえる。しかし、なぜクエン酸ナトリウムと塩化ナトリウム時は小さな結晶しかできなかったのに、今回大きな結晶ができた理由はわからなかった。 | |||
２１回目（phosphate3－―ＮａCl）
２０回目同様の理由で行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×32 |
×24 |
×28 |
×20 |
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クエン酸と塩化カリウムのとき同様に、大きな結晶ができた。今まで塩化カリウムとナトリウム塩緩衝溶液での結晶は、塩化ナトウムとナトリウム塩緩衝溶液での結晶の大きさの傾向とは、違うことがわかった。 | |||
２２回目（CH3COOＮａ―NaCl）
今まで、実験を行っていなかったｐH（等電点方向）で実験を行う。
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１ (pH=6.0) |
２(pH=6.5) |
３(pH=7.0) |
４(pH=7.5) |
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×14 |
×14 |
×16 |
×20 |
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予想外に大きな結晶ができた。結晶の形も六角柱もので、結晶の数も少なく３～5個だった。しかし、等電点(ｐH＝9.2)に近づくと結晶が小さく傾向があるようだ。 | |||
２３回目（CH3COOＮａ―NaCl）
４％６％
沈殿剤を減らし２％4％にした時、結晶ができなかったので今度は沈殿剤を少し増やして実験を行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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×40 |
×40 |
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沈殿剤の少量の増加では、結晶の大きさにはあまり影響がなかった。少し小さくなったようだった。また、ｐHの違いによる結晶の大きさへの影響はあまりないようだった。 | ||
２４回目（CH3COOＮａ―NaCl）
タンパク質濃度を増やしたとき、結晶は大きくなるか小さくなるか知りたかったため実験を行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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×40 |
×40 |
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タンパク質濃度の増加では、結晶の大きくなったようだった。結晶の数は、今までの実験でのものより少し多かった。結晶の形は、六角柱の物が多く数もみな同じくらいの数だった。 | ||
２５回目（CH3COOＮａ―NaCl）
さらにタンパク質濃度を上げて実験を行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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×40 |
×40 |
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結晶に大きなばらつきはなかったが、形は大きな違いができた。結晶の個数は、６～７個と少なかった。濃度を上げたことによる傾向は明らかにならなかった。 | ||
２６回目（CH3COOＮａ―NaCl）
酢酸緩衝溶液の濃度を変えたら、結晶にどのような影響があるのか知るために行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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×40 |
×40 |
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半日で結晶ができ始めてきた。結晶の大きさは、緩衝溶液濃度以外同じ条件の0.1mol/l酢酸緩衝溶液のものより小さかった。結晶の大きさの傾向は、0.1mol/l酢酸緩衝溶液のものと同じで傾向であった。 | |||
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２７回目（CH3COOＮａ―NaCl）
今度は、酢酸緩衝溶液濃度を上げ、さらにタンパク質濃度を上げたら結晶成長にどのような違いがあるか調べるために行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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×40 |
×40 |
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酢酸緩衝溶液0.1mol/lのとき同様、結晶が大きくなると思ったが大きくならなかった。そして、今まで多かった六角柱の結晶ではない形の結晶が多かった。結晶の大きさの傾向は、今までものと似たようだった。 | ||
２８回目（CH3COOＮａ―NaCl）
さらにタンパク質濃度を上げたらどうなるか行った。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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×40 |
×40 |
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さらに結晶の大きさが小さくなり、結晶数が増え、結晶が重なり合っていた。結晶の形は、バラバラでタンパク質濃度が1.5倍のとき同じだった。大きさの傾向はなかった。 | ||
９）崩れた結晶の成長
これは、実験５回目のものです。インキュベーターの温度設定のプログラミングミスで５℃になってしまい、結晶が砕けたり・ひびが入ったりした。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×40 |
×40 |
×40 |
×40 |
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５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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×40 |
×40 |
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５℃になってしまってから、設定を２０℃に直し約１ヶ月たったものです。
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１ (pH=4.3) |
２(pH=4.5) |
３(pH=4.8) |
４(pH=5.0) |
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×30 |
×24 |
×20 |
×20 |
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５(pH=5.3) |
６(pH=5.5) |
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カビが繁殖してしまった。 |
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×40 |
×40 |
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大きな結晶を核として、小さな結晶と間で溶解平衡が起きて表面積が一番小さくなり安定するために大きな結晶になったのだと思う。しかし、ひびが入った結晶のうえに層が出来たためきれいな結晶にはならなかった。
１０）結晶ができなかったセルの検証実験
キサントプロテイン反応を利用。濃硝酸を２～３滴結晶化用内液の部分に滴下。その結果、結晶化しなかったすべてセルに硝酸を滴下したら黄変したのでタンパク質がちゃんと加えられていた事が証明された（今回の実験でベンゼン骨格の有機物を使ってないので）。そして、どれも黄色の濃さが同じくらいのであったので濃度の間違いでもないと思われる。
１１）まとめ
○今回検討した、結晶成長に影響を与えると考えられる諸条件についてわかったことをまとめてみる。
① pH
4.8～5.3のとき大きな結晶が得られた｡pH値がより小さいと、小さな結晶しか得られない｡下の表にまとめた通り、明らかな違いはでなかった。
② 温度
あまり有意な差は、１回しかできなかったのでわからない。
③ 沈殿剤(NaCl)の濃度
結晶化用タンパク質溶液の沈殿剤(NaCl)の濃度が３％より小さいと、小さな結晶しか得られないか、結晶ができなった。そして、多くの種結晶が発生してしまうようだ。また、沈殿剤(NaCl)の濃度が３％より大きくても多くの種結晶ができるようだった。
④ イオン（沈澱剤）
昔からタンパク質の結晶化の沈澱剤として使われ、有名な硫酸アンモニウムがなぜリゾチームの結晶化では、使われてないのか？
今回の実験では、明確には分からなかった。硫酸アンモニウムのモル濃度を塩化ナトリウムの1.5倍にしても結晶ができなかった。それに、他の硫酸イオンを含んだ沈澱剤でも結晶ができなかった。一般理論上、価数が大きいと塩析能力も大きいはずである。しかし、似たような構造の硝酸イオンを含んだ沈澱剤で結晶ができたことからリゾチームは、１価の陰イオンと結合して、塩析を起こしやすいので硫酸アンモニウム（硫酸イオン）は適さないため使われないのだと思う。それは硫酸イオンの構造が大きいために、リゾチーム分子の隙間に入り込めず塩析を起こせなかったのかもしれない。
⑤ 平衡用外液
有意な差は、わからなかった。
以上のような結果になったが、今回の実験ではなぜｐHや沈殿剤の濃度を変えることで種結晶の発生する割合が変化するのかは、実験のまだ回数が少ないためと操作手順が良くないためによくわからなかった。
○文献値との違いとタンパク質の変質
ニワトリから取ったリゾチームは、３）文献では２０℃で酢酸緩衝溶液濃度0.1mol/lでpH=4.7にして沈殿剤のNaClの濃度を2.5~3.0％と5.0％で行うとよい。と、書いてあった。だがしかし、今回自分たちのチームの実験結果は、文献とは一致しなかった。その理由として考えられるのは、次の事柄である。
① 結晶化用タンパク質溶液を調製中に冷やしすぎて、一部が白くなり変質してしまった。
② タンパク質を移し変えているときや撹拌しているときに、空気と混ざってしまいタンパク質が変質した。
③ 試薬(リゾチームと沈殿剤)の不純物が影響した。左下の写真(20倍)のよう傷(ギザギザ)できた。
④ クリスムチャンバーにタンパク質溶液を移し変えているときなどに、クリスムチャンバー内に結晶の核となりえるほこりなどの不純物が入った。右下の写真(20倍)のようになった。(大きくなりすぎてひびが！？)
⑤ クリアーテープの張り方が悪く、蒸気平衡が乱れた｡
以上などのいろいろな原因が考えられる。
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１２）課題(やってみたかった事など)
① 日々の観察をしっかりやり結晶の成長速度を明確にしたい。
② pHに関して、もっとpHの値を中性に近づけてみて、さらに塩基性の地域ではどうなるのか試してみたい。
③ 時間経過における温度勾配をつけ、結晶成長の手助けをしてみたい。
例えば、始めは高めにしてだんだん下げていく。
④ 沈殿剤の種類をいろいろと変えてみたい｡
⑤ 今回実験では､沈殿剤を少なくしたら良い結果が得られなかったので、沈殿剤を増やしみたい。
⑥ 蒸気圧を大きくすると良い結果が得られなかったので、蒸気圧を小さくしてみたい。
⑦ エタノールなどの有機溶媒や最近よく使われているPEG(Poly Ethylene Glycol)などを沈澱剤として使いたかった。エタノールなどの有機溶媒は、低温(０℃以下)でなければ、タンパク質を変質してしまうので行わなかった。
⑧ タンパク質は、酸性下でHCOOH－R－NH３＋（Rは炭素鎖）と電離してプラスの電荷を帯びているので、マイナスの電荷である陰イオンが配位しいていると考えられる。なので、今回できなかった陰イオン、特に塩化物イオンと似たような性質を持つハロゲンイオン、２価・３価の陰イオンを沈澱剤として使ってみたかった。
⑨ 沈澱剤として、マイナスの電荷をもつ非電解質・高分子。コロイドなどを使ってみたかった。
⑩ モーゼ効果を利用して、微小重力環境をつくりより大きい結晶をつくりたかった。
うまくやれば、強い永久磁石や電磁石でできるらしい。しかし、インキュウベーター内に設置できないかったので断念した。
（モーゼ効果とは、磁力を重力と逆方向に働かせる事によって微小重力環境をつくること）
１３）適切な結晶化の方法
タンパク質を結晶化させるための手法としては，様々なものがあります．その中で，代表的なものとして，蒸気拡散法，バッチ法，液液拡散法，透析法の４つを取りあげ，右下図にその特徴をまとめてみました．縦軸はタンパク質濃度，横軸は沈殿剤濃度です．図中(A)のカーブが溶解度曲線にあたります．タンパク質濃度および沈殿剤濃度が増加するほど，渦巻き成長→二次元核成長→付着成長と結晶の成長メカニズム変化して行く様子は，＊４）で述べたとおりです．さて，図中の青い矢印は，各結晶化手法を用いた際に，タンパク質および沈殿剤の濃度がどの様に変化して行くかを示しています．
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適切な結晶化方法の選択
http://www.cir.tohoku.ac.jp/sazaki-p/%20Web_pages/Protein_crystallion/04_Basic_strategies.html#active-growth-operationより (＊４)は、上のホームページを参照)
溶解度
右図は、塩化リゾチームの平衡溶解度です。0.1mol/l
酢酸緩衝溶液，沈殿剤：塩化ナトリウム（A；３％
B；５％ C；７％）batch(バッチ)法で
溶解度曲線が、波打っていることから結晶化の条件を導き出すが難しいことがわかる。
〇今回行った実験方法、蒸気拡散法は結晶化条件を探すのに適しているが良質な結晶を作るのが不向きである事がわかった。しかし、今回自分たちの実験目的としてある程度蒸気拡散法がてきしていた。もし今後、この実験をする機会があったらバッチ(batch)法で行ってみたい。
〇良質の結晶を作る条件は、過飽和度（駆動力）を知る事が重要である｡上のグラフを見て分かるように温度・ｐＨ・沈澱剤濃度が平衡溶解度に密接に関わってくる。過飽和度のバランスを考えれば、良い結晶を作れることがわかった。
まず、化学ポテンシャル差
⊿μ=kBT In(C/Ceq.) ＝(μ＊＋kBT InC)－(μ＊＋kBT InCeq.)
によって、今回やった実験について考察する。ただし、ここでは⊿μは溶液中と結晶中の化学ポテンシャルの差、μ＊＝標準化学ポテンシャル、ボルツマス定数kB=1.38×10‐23 [J/K]、絶対温度T [K]、タンパク質結晶化用溶液濃度C[mg/ml]、４）リゾチームの溶解度Ceq. [mg/ml]、アボガドロ数NA=6.02×1023 [1/mol]、気体定数R= kB ×N=8.31 [J/K mol]する。
⊿μ=kBT In(C/Ceq.)より
“粒子（分子）１個”のため、１モルあたりの値に直すために，アボガドロ数N=6.02×1023 [1/mol]をかける。
∴ ⊿μ＊=RT ln(C/Ceq.)
例えば，１分子について計算するとkB=1.38×10‐23 [J/K], T=300[K]，C=50[mg/ml], Ceq. =14 [mg/ml]の値を代入すると⊿μ= kBT In(C/Ceq.)＝5.27×10‐21 [J]となります．アボガドロ数N=6.02×1023 [1/mol]をかける。そうすると，⊿μ＊=RT In(C/Ceq.)=3170[J]=3.17[kJ]となって，実感がわきやすく普段見聞きするエネルギーの値に近くなります。
物理の分野では，その値を熱エネルギーの値kBTでわって，⊿μ＊/ kBTとすることで表すことが多いようです．そうすると，⊿μ/ kBT =⊿μ＊/RT =1.27[-]となって，単位系に惑わされることがなくなります。意味は，熱エネルギーの約1.3倍化学ポテンシャルがかかっているということを表します。
例えば，水素結合（水の場合、約２～８[kcal / mol](＝8.3～33.5[kcal / mol])）など生化学的に重要な結合が起こるために必要なエネルギーが約数くらいなので，⊿μ/ kBT =⊿μ＊/ RT=1.27 [-]だけの駆動力がかかっていると言うことは，その事象は起こりやすい（実現しやすい）と言うことを示しています。
注：これ以降の（ ）内の数字は､実験回数を表す。そして、⊿μは１モルあたりの化学ポテンシャルを表す。ただし、タンパク質濃度は変化ないものとし、沈澱剤が完全に平衡状態に達し水が移動して沈澱剤濃度だけが変化したと仮定する。
(1) ①⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/2.21) =6351
②⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/2.51) =6041
③⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/1.78) =6877
④⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/2.44) =6109
(２) ①⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/1.34) =7569
②⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/1,36) =7532
③⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/1.70) =6989
④⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/0.949) =8406
(４) ①⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×303×In(30/8.94) =3048
②⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×303×In(30/6.94) =3656
③⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×303×In(30/7.63) =3447
④⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×303×In(30/12.5) =2204
⑤・⑥データなし
(５) ①⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/3.96) =4930
②⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/3.17) =5472
③⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/2.53) =6021
④⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/3.46) =5459
⑤⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/3.27) =5397
⑥⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/2.71.) =5854
(２５) ①⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(45/3.96) =5918
②⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(45/3.17) =6459
③⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(45/2.53) =7009
④⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(45/3.46) =6246
⑤⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(45/3.27) =6383
⑥⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(45/2.71.) =7542
(２６) ①⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(60/3.96) =6618
②⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(60/3.17) =7160
③⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(60/2.53) =7709
④⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(30/3.46) =6947
⑤⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(60/3.27) =7084
⑥⊿μ=RT In(C/Ceq.)＝8.31×293×In(60/2.71.) =7542
過飽和度（駆動力）は、予想通り沈殿剤を増やしたときとタンパク質溶液を増やしたときには大きな値になり、気温を上昇させた時には小さな値になった。しかし、結晶の大きさとの相互関係はわからなかった。
実験をやっていて、後半の方の時期になってわかった事がある。今回やった実験を通して大きな結晶を作り出せた条件は、結晶を観察せずにクリスケムチャンバーを静置しておくことだった。今回の実験では、最も大きな結晶は観察せずに約１週間静置しておいたものだった。
最も結晶が大きくなったのは、ｐＨを上げ等電点に近づけたときだった。しかし、その時の
ｐＨは等電点近くてはなく、ｐＨ=6.0のときだった。等電点近づく事により分子間の反発が小さくなる事と沈澱剤の影響が複雑に関係しているためだと思う｡しかし、明確な理由はわからなかった。
１５）反省点
今回のタンパク質結晶化の実験では、濃度の計算を間違えたりする事があった。インキュベーターの温度が５℃になってして、結晶にひびが入って結晶の形が崩れてしまった事などあった。（これは、僕たちの責任ではないけど…。）また、湿度が高い時期や暑い時期があったので結晶化をするはずだったのに、細菌を繁殖させてしまった。自分なりに丁寧にやっていたつもりであったが、結晶を見てみるとホコリか何か不純物が核となり変な結晶ができてしまった。
など、もっと真剣にやっていれば防げた(？) 事や仕方ない事などがあった。今では、もう遅いがもっと多くの文献を読んでおきたかった。
１６）感想
今までやってきた実験と違い、わからないことが多かった。実験自体も経験と技術が必要である事がわかった。実験を多くやったけれど、これといった傾向や結論を出せなかった事が心残りである。しかし、今回のタンパク質結晶化の実験で、今まで読んだことがないような難しい本などを呼んだ。自分なりに納得でき、とてもいい経験をした。
今まであまり興味を持っていなかった生化学に興味を持ち、これから大学に入ってからもこの分野に関心を持ち続けていきたい。
１７）参考文献
１） 理化学辞典，第３版増補版，岩波書店
２） 生化学化学工業株式会社製品解説
http://www.seikagaku-hit.com/cgi-bin/search/detail.cgi?code=100940より
３） 水島三一郎，赤堀四郎，｢蛋白質化学｣，共立出版
４） リゾチームの溶解度
E．Cacioppo and Ｍarc. Ｌ. Journal of Crystal Growth, 114, (1991) 286－292
http://otis.msfc.nasa.gov/biophys/biophys.html
５） 参考論文
G．Sazaki et al. Journal of Crystal Growth, 196, (1996) 355－360
７）タンパク質結晶化全体
資料の文章と画像は、東北大学金属材料研究所講師 佐崎 元先生の御好意により頂いた資料です。また、この資料は今年８月に出版された 佐崎 元，"第４章１節 タンパク質"，佐藤清隆 (ed.),結晶成長のダイナミクス;
第６巻 溶液成長のメカニズム; 構造と形のデザイン, p141～155 (共立出版，東京, 2002).からです。
御好意、とても感謝いたしています。